高通量单细胞测序是近年来生物学领域最热的技术之一，凭借其极高的分辨率能够精准的剖析样本细胞组成信息，结合高通量测序方式，进而大规模的揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，并反映细胞间的异质性。序。另外，现有单细胞平台可以一次性分离几千个单细胞，有助于发现新的细胞类型。随着单细胞测序技术的不断更新和发展，其在解析细胞异质性、揭示微环境中细胞群体间的关系、追踪疾病发生发展等研究中越来越发挥重要的作用，后续可为个性化预防、治疗提供技术支持。

 

肿瘤细胞异质性

 

一、高通量单细胞测序技术的优势

 

单细胞测序技术，就是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观基因组及蛋白组等水平进行测序分析的技术。众所周知，相同或不同组织、器官、系统中的细胞均存在异质性，这不仅体现在形态结构上，由于细胞的命运由遗传物质决定，其本质差异更体现在基因组、转录组、表观组等层面。传统的测序，是在多细胞基础上进行的，实际上得到的是一堆细胞中信号的均值，丢失了细胞异质性（细胞之间的差异）的信息。因此可对不同组学展开单细胞研究，其优势在于能够避免混合（Bulk）样本的均质化掩盖单细胞的异质性，可以在单细胞水平深入探索健康生理和疾病异常下的细胞状态，从而很好的解决了这一问题，进而为了解生物体的功能机制和发现更为有效的疾病治疗方法奠定了基础。

 

单细胞转录组测序示意图

 

传统的二代测序中，转录组测序（RNA-seq）最为人所熟知。RNA-seq是提取组织、器官或一群细胞的混合RNA（bulk RNA）进行测序，能够得到的是一群细胞的转录组的平均数据，细胞群体中单个细胞的特异性信息往往被掩盖（比如特异表达的基因或RNA不同的剪接体）。而随着对生物结构功能的深入研究，人们越来越清楚地认识到，哪怕看似相同的细胞群，细胞之间的转录组表达水平也是存在差异的。以肿瘤为例，肿瘤中心的细胞，肿块边缘的细胞和肿块周围的细胞，乃至远端转移的细胞，其转录组等遗传信息一定是存在差异的，而传统的研究手段通常将整个肿块整体进行研究，或者将肿块简单分区分割，得到每一部分细胞基因表达的平均值，丢失了每个细胞的异质性信息，使科研人员对肿瘤微环境中各种细胞转录组表达及免疫功能的理解和认识始终无法深入。由此可见，为了得到原始和真实的细胞遗传信息，对转录组的分析须在单细胞水平上展开。单细胞表达谱测序技术可以从混杂组织中捕获单个细胞，并能从中够获取单个细胞的表达信息，检测出混杂样品中细胞的异质性数据。

 

单细胞测序和传统测序的区别

 

二、高通量单细胞捕获技术的发展

 

单细胞分离是从单个细胞获得转录组信息的第一步。早期的单细胞获取方式，是通过一定的技术手段，将单个细胞分离出来，并利用SMART-Seq2或商业化的SMART-Seq4试剂独立构建测序文库，最终进行测序。捕获方式主要包括：有限稀释法，流式细胞分选法，激光切割法，显微操作法等。这些方法虽然各有各的优点，但各自的缺点也十分明显。

 

限制稀释是一种常用的技术，其中用吸管稀释分离单个细胞。一般情况下，当稀释到每层0.5个细胞的浓度时，在孔板中只能得到约三分之一的制备孔板。由于细胞的这种统计分布，这种方法不是很有效。显微操作法是从早期胚胎或未培养的微生物中提取细胞的经典方法。和显微镜引导的毛细管吸管已被用于从悬浮液中提取单个细胞。但是，这些方法耗时长、通量低。最近，流式细胞分选（FACS）已成为分离高度纯化单细胞最常用的策略。当目标细胞表达非常低水平的标记时，FACS也是首选的方法。在这种方法中，首先用荧光单克隆抗体标记细胞，该抗体可以识别特定的表面标记并对不同的群体进行分类。另外，对于未染色的群体，也可能出现阴性选择。在这种情况下，根据预先确定的荧光参数，使用静电偏转系统将电荷施加到感兴趣的电池上，并对电池进行磁隔离。这些技术的潜在限制包括需要大的起始量（难以从少于10,000的低输入数中分离细胞）和需要针对感兴趣的蛋白的单克隆抗体。激光切割法利用计算机系统辅助的激光系统从固体样品中分离细胞，该方法操作复杂，捕获成本也高。

 

单个细胞的主要分选方式

A.    有限稀释法；B. 流式细胞分选法；C. 激光切割法；D. 显微操作法

 

微流控技术由于其样品消耗低、分析成本低以及能够实现精确的流体控制，使得用于单细胞分离的微流控技术得到了广泛的应用。微流控系统通常是完全自动化和封闭的，这降低了外部污染的风险。也很容易实现无菌的工作环境，因为微流控系统经常依赖一次性元件（例如微流控芯片）。然而，系统内裂解或受损细胞的内部交叉污染风险差别很大，但这取决于应用的方法，因此需要监测。所有微流控方法的共同优点是通量高、精度高和成本低。目前，微流控单细胞捕获方法大致可分为三种工作原理，即微结构技术、流体动力学方法和微液滴技术。

 

微结构技术利用纳升数量级微结构或隔室设备组成高密度的阵列，在最简单的版本中，微结构装载低密度细胞溶液，确保每个微结构只有一个细胞，通过这种方法可以实现高通量的单细胞捕获，能够同时捕获数以百万计的单个细胞。根据应用情况，微结构采用封盖结构（如玻片）或疏水液体（如油）密封，为每个微结构提供独立的反应体积。通过调整微结构尺寸以达到目标细胞的平均尺寸来避免双细胞。目前，BD Rhapsody、Clontech ICell8和Fluidigm C1单细胞商业平台采用该技术。

 

流体动力学方法利用流体的迪恩流（Dean flow）效应，它是由流体惯性引起的，导致形成一个垂直于原始流动方向的漩涡。不同大小、密度或形状的细胞对这种惯性效应的表现是不同的，通过这种惯性效应，它们集中在涡旋内的不同位置。这样就可以对单个细胞进行无标记的被动分离。与基于微结构的系统相比，这些流体力学方法建立了连续的流体流动，与芯片上有限数量的微结构相比，允许更高的通量。理论上，使用流体力学方法的单细胞捕获方式就代表了高通量、高精度和低成本。然而，实际设计存在着器件制造的可靠性和复杂优化设计的必要性等局限。此外，还需要为高级应用程序解决用户界面问题。以上都使得制造和操作复杂化，从而增加了成本。

 

到目前为止，在单细胞应用中，能够控制最小体积流体的基于液滴的微流控方法可能是最有前途的技术。在惰性载体油相中，液滴系统能从水相中产生微米级、表面活性剂稳定的液滴。这些液滴构成了被惰性油相和表面活性剂分离的单独捕获和反应体积，通过限制分析物（如DNA或RNA）向油相及邻近液滴的扩散，共同防止交叉污染。基于此，2015年，inDrop和Drop-Seq两种方法在单细胞转录组测序方面取得了重大突破，它们结合了微流体和核苷酸条形码进行回顾性鉴定。这些方法能够对数千个细胞进行平行分析，用于多种测序方法。后续，这些技术被转移到商业化和优化的平台，如10x Genomics、 Dolomite Nadia和ddSeq系统，增加了灵活性，导致单细胞mRNA文库构建的成本大幅降低。基于液滴的细胞分离和分选技术的一大优势是每秒可达数千个单个细胞的巨大通量和低技术噪音。此外，处理和修改每一个液滴的可能性是这项技术的独特之处，允许液滴的合并、孵育、回注和分类。

 

微流控技术分选单细胞

A．微结构技术；B. 流体动力学方法；C. 微液滴技术

A．根据单个细胞的大小，将其被动地困在微孔中。微结构可用薄膜或载玻片密封，隔离后用显微镜观察。细胞或组分可以从井中重新分离出来进行进一步处理。B. 螺旋分选机利用dean flow效应对细胞进行尺寸/重量分离，并可能通过不同的出口通道进行隔离。在入口处随机分散的细胞集中在通道中不同位置的螺旋上，使细胞能够分离和隔离。C. Drop-Seq微流控装置原理图概述。

 

10x Genomics微液滴技术

 

三、高通量单细胞测序技术的应用

 

高通量单细胞测序数据统计分析改变了以往人们对细胞研究的认知方式。细胞生活在动态环境中，与周围环境相互作用。通过主成分分析（PCA）可以用来识别已知和未知的细胞簇。在二维投影归一化基因表达谱后，可以进行细胞层次重建。对调控网络的解码整合了伪时间推断的轨迹，并在二维空间中聚类基因表达信息。整体而言，高通量单细胞测序数据统计分析有三个大方向，分别为细胞类型鉴定、推断基因调控网络以及细胞层次结构的重构。

 

对人体中众多细胞的鉴定是一项艰巨的任务，细胞具有巨大的潜在状态，它们可以在发育过程和疾病进展中采用这些状态。PCA是一种广泛应用的无监督线性降维方法。通过将细胞投影到二维空间中，可以很容易地可视化样本，提高了解释能力。此外，还可以利用其他非线性降维方法，如t-SNE、多维尺度、局部线性嵌入和Isomap。t-SNE在Cell Ranger pipeline（10x Genomics）和Seurat的R包中实现。聚类是另一种检测低质量细胞的有效方法，该方法是通过特异性地识别富含线粒体（mt）基因的聚类。研究表明，当细胞膜破裂时，mtDNA基因上调，细胞质RNA丢失。一旦划分完成，下一步就是识别不同簇间差异表达的标记基因。

 

基因调控网络（GRNs）的阐明可以增强我们对活细胞复杂细胞过程的理解，这些网络通常揭示基因和蛋白质之间的调控相互作用。值得注意的是，GRN的测定并不是生物学研究的最终结果，而是连接基因型和表型的中间桥梁。高通量单细胞测序使推断GRNs变得更容易，因为可以一次性捕获数千个细胞，进而增加了统计能力。目前有众多的分析方法，可以分为基于机器学习的，基于共同表达的、基于模型的，和基于信息理论的方法。近年来，从单细胞数据中识别GRNs的方法得到了广泛的应用，并成功地应用于T细胞生物学中，为共表达分析数据提供了新的思路。

 

个体的细胞不断处在动态过程中，这一动态过程会反映在细胞的分子结构中，如RNA和蛋白质的含量。我们可以应用算法来重建与细胞分化或细胞周期进展相关的动态细胞轨迹。在Monocle算法中引入了伪时间的概念，该算法测量细胞的生物进程。在这里，伪时间的概念与实时不同，因为细胞是一次性采样的。该算法已被用于从多个时间点测量的基因表达谱中恢复小鼠胚胎早期发育阶段的谱系。

 

高通量单细胞测序分析应用方向

 

高通量单细胞测序技术正在彻底改变我们对生物学的基本理解，这项技术开辟了超越细胞状态描述研究的新研究领域。随着精准治疗时代的到来，已经有许多令人兴奋的医学应用利用这项技术，尤其是在肿瘤、神经科学、免疫学、微生物等领域，应用会越来越广泛。

 

在肿瘤研究领域，单细胞研究可以以更高的分辨率探索驱动癌症的细胞类型和状态，揭示癌症的真正复杂性，帮助研究人员探索肿瘤异质性以及肿瘤微环境（TME）的复杂相互作用。2021年6月，Cell 杂志发表了一篇通过单细胞分析探测肿瘤的血管选定研究。该研究采用单细胞转录组测序技对31,964个具有AAT（抗血管生成）抗性小鼠的肺肿瘤血管内皮细胞（TECs）和周细胞进行了检测。结果显示实验组与健康对照组的TECs和周细胞的表达谱都非常相似。同时还发现基质重塑巨噬细胞有助于浸润性癌细胞的血管选定，M1样巨噬细胞亚型可使血管细胞保持静止。

 

在免疫学研究领域，用单细胞多组学表征重新定义免疫学，加深我们对免疫系统复杂的应答反应和相互作用网络的理解。2021年9月，Nature Communications 在线发表了川崎病的单细胞研究，研究人员开展了免疫球蛋白治疗前后的川崎病和正常儿童的外周血单个核细胞（PBMC）单细胞转录组研究，揭示了川崎病发病和治疗过程中外周免疫细胞及其亚型的动态变化。

 

在神经科学研究领域，通过单细胞测序，可以更深入地了解神经系统，并加快探索那些驱动复杂且多因素的神经退行性疾病、精神疾病和神经发育疾病背后的基础生物学。2019年5月，Nature 报道，通过对24名阿尔茨海默病人和24名正常人尸检大脑样本的8万个细胞进行单细胞转录组测序。研究不仅分析出兴奋性和抑制性神经元，还分析稀有的非神经元脑细胞，如少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。这些细胞类型中的每一种在阿尔茨海默病患者中都表现出明显的基因表达差异。其中，轴突再生和髓鞘形成相关的基因在阿尔茨海默症中表现出明显差异。

 

2020年，COVID-19席卷全球，在该领域单细胞测序同样能发挥重要作用，通过单细胞测序可以揭示COVID-19及其病理生理学特征，以及细胞介导的免疫反应。2020年7月，北京大学谢晓亮团队在Cell 上发表了一篇关于新冠病毒特效药的文章。此项目首先从60名新冠康复病人的血液中分离出B细胞，利用单细胞转录组+单细胞BCR测序技术对这些B细胞进行检测，筛选出8,558种病毒蛋白结合抗体序列，并找出14株高活性的中和抗体。之后进行小鼠实验，最终成功筛选出一种非常有效的中和抗体BD-368-2。经实验证实，此中和抗体可以大幅度提升新冠治愈率，缩短治愈时间，甚至可以提供短期的病毒免疫，在治疗和预防方面都发挥重要作用。

 

四、高通量单细胞测序技术的未来

 

从2009年首个单细胞RNA测序技术问世，单细胞测序技术在十余年的时间得到了迅速发展，2011年被Nature Methods 杂志推荐为年度最值得期待的技术之一，2013年被Science 杂志推荐为年度最值得关注的六大领域榜首。同时，单细胞测序技术在生命科学和医学研究领域的应用也日益受到了关注。2017年单细胞生物学研究被Nature 和Science 同时封面推荐。特别是，2017年人类细胞图谱计划启动，为单细胞测序技术应用提供了非常广阔的空间。2018年单细胞转录组技术被Science 评为年度突破技术。2019年单细胞多组学被Nature Methods 杂志评为年度技术，预示着单细胞多组学研究将成为趋势。2020年Nature 发表世界首个人类细胞图谱，首次从单细胞水平上全面分析了胚胎和成年时期的人体细胞种类。

 

单细胞技术将为高分辨率研究细胞分群和组织功能研究提供重要的支撑，发现组学间关系、记录动态生物活动具有非常重要的意义，随着众多高通量单细胞研究平台的出现和商业化，使得单细胞测序技术的使用门槛大大降低，不仅实现了细胞通量（实际测到的细胞数量）的飞跃，而且大幅降低了单个细胞的检测成本。目前，全球潜在科研市场体量已经达到130亿美元以上，单细胞测序技术的市场更以年均20%以上的速度逐年增长。另外，单细胞测序技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔，正在推动癌症及肿瘤研究、发育生物学、微生物学研究、免疫、以及神经科学领域向前发展，并逐渐成为生命科学研究的焦点。

 

李超   | 文案

 

 

————关于百奥益康————

 

北京百奥益康医药科技有限公司（以下简称“百奥益康”）是天津百奥医药科技有限公司的全资子公司，致力于提供前沿的单细胞组学全套解决方案，单细胞相关研发和服务团队位于北京亦庄。

 

百奥益康现有管理团队和技术团队具有丰富的单细胞测序服务和研发经验，在单细胞研究领域深耕6年，曾成功领导打造了国内领先的单细胞科研服务团队，现已累积150+种不同组织类型、10,000+个样品的10x Genomics单细胞测序经验，累积服务客户发文数十篇，影响因子近千分（包括CNS顶级期刊）。

 

 

 

百奥益康技术团队已累积经验的消化组织类型（人）

 

百奥益康技术团队已累积经验的消化组织类型（小鼠）

 

咨询单细胞测序相关服务，请扫描二维码

我们将本着专业、认真、诚信及热诚的态度

向您提供我们的服务！

 

地址：北京经济开发区宏达南路5号3层

电话：15201658362

邮箱：info@bestopmed.com